结直肠癌（Colorectal cancer, CRC）是全世界范围内与癌症相关死亡的第二大主要原因，尤其是在50岁以下的个体中其患病率正逐步攀升。CRC作为肠道上皮的异质性疾病，其特征在于突变的累积和免疫反应的失调。越来越多的证据表明，高达90％的疾病风险是由饮食等环境因素所致，这与近些年来提出CRC相关“致癌菌群”的文献报道相一致。然而，与众所周知的幽门螺杆菌在胃癌中的因果作用不同，目前尚未鉴定触发CRC的特定微生物。这种肠道菌群失调是导致CRC的直接原因还是仅仅代表“旁观者效应（bystander effect）”尚不清楚。因此，破译驱动CRC的特定致病菌群或代谢产物并表征其潜在机制十分必要。 近日，来自牛津大学的Fiona Powrie课题组在Nature 杂志上发表了一篇题为“Host–microbiota maladaptation in colorectal cancer” 的综述，系统回顾了截至目前已报道的CRC中宿主与肠道菌群的相互作用，重点分析与肠道屏障破坏，基因毒性和炎症反应的有关机制，这一领域存在的未知和挑战以及新兴技术的应对策略。
一、宿主建立对肠道菌群的防御屏障
长期以来，哺乳动物结肠与多样化的微生物生态系统共同进化，在一定程度上通过在宿主中形成强大的免疫系统，以促进宿主和微生物群落的互利共赢。维持这种平衡的关键是肠道上皮细胞（intestinal epithelial cells, IEC），它们在宿主-菌群交界面上形成单层物理屏障，并由位于肠隐窝（intestinal crypts）中的多能性肠干细胞（multipotent intestinal stem cells）不断给予补充。IEC的增殖受干细胞龛（stem cell niche）的调节，并涉及底层间充质的旁分泌信号传导，而上皮间紧密连接蛋白与保护性粘蛋白的分泌协同增强屏障的完整性。
除去物理屏障的作用，IEC还通过模式识别受体来感知微生物群。这些受体的刺激促进上皮细胞修复和紧密连接蛋白的上调，并触发将信号传递至固有层细胞的多种细胞因子产生。至关重要的是，上皮细胞并非独立存在，而是与免疫细胞和间充质一起形成“三元组（triad）”。如果微生物或其产物破坏了上皮屏障防线，那么免疫细胞和间充质细胞将通过启动一系列支持上皮完整性的信号网络来充当第二道防御线。例如，NF-κB和STAT3通过的激活可以触发支持体内稳态组织修复生长因子和细胞因子的产生。尽管间充质细胞是动态的，并且对于维持体内平衡至关重要，但是需要进一步的工作来确认它们是否与微生物群存在直接相互作用。
二、CRC的危险因素
虽然尚未揪出CRC的真正致病元凶，但已有大量证据指出相关危险因素。与炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）相关的炎症，以及遗传性基因缺陷如家族性腺瘤性息肉病和Lynch综合征是已知的遗传危险因素；数学建模将70-90％的风险归因于环境因素，尤其是纤维含量低而红肉含量高的饮食习惯；此外，致病性感染也是公认的环境触发因素，例如于1991年发现的幽门螺杆菌与胃癌的联系。当然，无论CRC的始发因素是什么，通常都涉及体内稳态免疫和微生物群衍生信号的破坏，刺激产生上皮细胞过度修复的反应。这类反应往往会导致肠道干细胞内一连串基因突变诸如APC，KRAS或PIK3CA，以起始肿瘤发生。
肠道炎症被认为是CRC中的“双刃剑”。原位T细胞的数量与CRC积极的临床结局相关，利用免疫系统进行抗原特异性清除仍然是许多治疗策略的目标。然而，肿瘤通常通过免疫编辑肿瘤抗原而逃避这种免疫介导的破坏，使其无法被检测到。尽管先天性免疫细胞（例如中性粒细胞和巨噬细胞）可以帮助清除肿瘤，但在某些情况下，它们会释放活性氧，这可能通过破坏IECs的基因组完整性来引发致癌级联反应。因此，肿瘤细胞创建了一个恶性循环，其中微环境中的许多细胞（包括驻留的成纤维细胞）可以被重新编程以产生额外的生长因子，细胞因子和促血管生成因子，从而维持不受限的增殖和侵袭。
图1，健康个体和CRC个体中宿主与肠道菌群相互作用示意图
三、CRC患者往往伴随肠道菌群失调
CRC中宿主与菌群的相互作用关系被初步证明于1975年，当时观察到致病性二甲基肼在无菌大鼠中诱发的结肠肿瘤明显少于肠道菌群正常的大鼠。此外，相对于接受健康菌群的小鼠而言，接受CRC粪便菌群的小鼠肠息肉数量更多。由于包括16S rRNA和鸟枪法宏基因组学（shotgun metagenomics）在内的微生物组分析技术的发展，与健康对照个体相比，CRC患者的肠道菌群成分有差异是无可厚非的，被概括为“菌群失调”。在CRC肿瘤组织中检测出较高含量的核梭菌、大肠埃希氏菌、脆弱拟杆菌、粪肠球菌、解脲链球菌和消化链球菌菌种，而所谓的保护性菌属包括罗氏菌、梭菌、费卡杆菌和双歧杆菌在内的细菌数量明显减少。这些差异中的一些（梭菌水平最一致）与临床结局和化疗敏感性相关，因此这类细菌具有作为生物标记物的潜力。然而，这种菌群类型和数量的变化究竟是癌症的原因还是结果，是否能将CRC的发生归因于某些特定的“致癌”微生物，仍具有挑战性。
四、CRC相关菌群可致基因毒性
如果要定义单个微生物或群落具有致癌性，那么它们必须发挥致癌作用，比如DNA损伤。近期有许多研究报道了与CRC相关的基因毒性，其中包括产大肠菌素的聚酮化合物合酶（pks）+大肠杆菌（以下简写为pks+E.coli），肠毒性脆弱性双歧杆菌（ETBF），粪肠球菌和产生细胞扩张毒素的空肠弯曲菌。尤其是pks+E.coli可致双链断裂，异倍体型和不正确的细胞分裂。在具有遗传易感性的Il10-/-小鼠中，pks+E.coli和ETBF可以诱导8-氧代鸟嘌呤DNA损伤，这些损伤与结肠肿瘤的发生率具有很高的相关性。ETBF毒素可以上调精胺氧化酶水平，从而导致活性氧的产生和DNA损伤标记γ-H2A.x的诱导。
五、肠道菌群驱动的代谢物的影响
尽管饮食可以直接致癌，它同样也可以通过改变特定物种的丰度和代谢物来影响肠道生态系统。例如，与高硫代谢细菌水平增加相关的饮食与远端结肠癌和直肠癌的风险增加相关；高脂饮食与CRC的复发以及某些微生物的胶原蛋白水解活性相关。为鉴定与CRC相关的候选代谢物，已有研究针对Lynch综合征和CRC患者的粪便进行了蛋白质组学分析。这些研究确定了氧化代谢微环境的增强，这被认为是由于CRC患者结肠中活性氧和活性氮的含量增加以及破坏DNA的胆汁酸脱氧胆酸的浓度增加。在缺少游离脂肪酸受体2（FFAR2）的小鼠中观察到肿瘤发生增加，这被认为是由于IEC完整性降低，细菌大量涌入，树突状细胞过度活化以及CD8 + T细胞表型耗竭所致。
六、炎症反应在CRC中的作用
炎症是结直肠癌发生的公认驱动因素，因此患有IBD的个体患CRC的风险增加。然而，菌群塑造肿瘤免疫环境的途径，进而改变周围微生物群的方式，是正在进行的研究的重点。肠道上皮屏障的破坏使得被分隔的微生物流入组织。有研究报道，缺乏模式识别受体相关基因Nod1，Nod2和Ripk2的小鼠肿瘤多样性和IEC通透性增强，强调宿主防御和IEC功能在预防肿瘤发生中的重要性。
由肠道屏障缺陷导致的细菌转移与多种癌症相关促炎因子的产生相关，包括IL-1β，IL-23，IL-22，IL-27，尤其是IL-17A和IL-6。与此相一致，在小鼠和人类中，发现有细菌浸润的肿瘤中，IL-6，IL-23和IL-17A的表达均发生上调。此外，IL-6与IEC上的受体结合以触发异常增殖。此外，受体表达模式的重要性通过一项研究得到例证，该研究表明，IL-1受体的CD4+ T细胞特异性消融减少了肿瘤诱发的炎症反应，而髓样细胞该受体的缺乏则会增加细菌入侵和IL-17A分泌，以及增殖肿瘤的数量和大小。
值得注意的是，许多细胞因子在CRC中显示多效性功能。例如，已知由菌群触发并由T细胞和固有淋巴样细胞产生的IL-22可以维持IEC增殖并在炎症过程中诱导抗凋亡蛋白的表达（促肿瘤发生的作用），但也可以在基因毒性损伤后，诱导屏障完整性和DNA损伤修复（抗肿瘤发生的作用）。当然，这些机制中的部分结论是从使用小鼠适应性病原体（例如肝螺杆菌）的模型系统中获得的。细胞因子在致癌过程中的不同作用取决于它们在疾病进展过程中的浓度和时间动态性，以及其他细胞类型，细胞因子等背景，而这些变量经常在许多还原研究中被忽略。
图2，肠道菌群促成CRC的已知炎症机制
七、炎症驱动的微生物生态位
对IBD的研究已经说明，不受控制的炎症会在结肠内产生不同的生态位（ecological niche），从而导致更适应的菌群存活。尽管这通常被认为是有害的，但这种细微差别的过程可能在进化上很重要。
特定“致癌”物种的丰富程度似乎部分取决于抗炎细胞因子IL-10，这说明了致癌过程中免疫适应不良的有害后果。的确，在IL-10敲除小鼠的肠中观察到基因毒性的pks+E.coli数量增加，且IL-10缺失与拟杆菌属，普氏杆菌属和里克氏菌属增加的丰度相一致。重要的是，菌群可以例如通过产生丁酸盐以反馈从而改变IL-10的水平。丁酸酯特异性受体GPR109A的下游信号可以抑制炎症驱动的致癌作用，并使巨噬细胞和树突状细胞使CD4+ T细胞偏向产生IL-10的T调节细胞。类似于IL-10，IL-33的缺失也会增强对炎症驱动的结肠癌的敏感性。值得注意的是，将IL-18缺陷型和野生型小鼠共居以实现菌群转移，这一操作引起野生型小鼠中炎症诱导的CRC患病率增加。相反，一些研究报道IL-18可能通过抑制产粘液的杯状细胞成熟来促进DSS诱导的结肠炎。这些看似矛盾的数据也可能是由于不同的时空因素，剂量因素等造成，但关于这点还未能得到明确结论。
八、“致癌微生物”引起免疫成分改变
肿瘤可以通过募集特定的免疫细胞来创建适宜肿瘤生长的微环境，其密度和成分能被菌群所影响。例如，吸引淋巴细胞的趋化因子CCL5、CCL20和CXCL11的水平与拟杆菌和厚壁菌门的成员相关，并且可以在体外被具核梭杆菌和大肠杆菌诱导。然而，这些化学诱导物是否募集保护性或致病性T细胞亚群尚不清楚，可能会受到基因背景的影响，在IECs中缺乏自噬调节基因Atg7的小鼠中，菌群与细胞毒性CD8+ T细胞和CD4+ TH1反应相关。因此，改变菌群以使其倾向于“热”肿瘤微环境（通常以浸润CD8+ T细胞和患者有益的结果为特征）将是一种有趣的治疗方案。
ETBF已被发现会在ApcMin /+小鼠中由STAT3激活驱动诱发促癌TH17的反应。这伴随着iNoshigh单核细胞样髓样来源的抑制细胞（M-MDSCs）的募集和分化，肿瘤内IL-17A与IL-17R +髓样细胞结合驱动Nos2上调。这些M-MDSC抑制了细胞毒性CD8 + T细胞的活性，同时诱导了涉及肿瘤生长（Mmp9）和血管生成（Vegfa）的基因表达。
与ETBF相似，在DSS诱导的CRC小鼠模型中用CRC相关溶脂链球菌进行管饲会导致肿瘤负荷增加，免疫抑制性CD11b +髓样细胞的选择性募集和髓样来源的细胞因子（包括IL-6和IL-8）水平升高。喂食具核梭杆菌的ApcMin / +小鼠的肿瘤负荷更大，同时伴随着免疫抑制性瘤内髓样细胞的增多。据报道，与CRC相关的厌氧消化链球菌可通过选择性粘附于结肠癌细胞并诱导NF-κb来触发ApcMin / +小鼠中促肿瘤髓细胞群体的扩张，以及T调节细胞，TH17和细胞毒性CD8 + T细胞频率同时增加。具核梭杆菌还可以以不依赖细胞因子的方式起作用，并直接抑制自然杀伤细胞的细胞毒性，从而使肿瘤能够逃避免疫系统追杀。用具核梭杆菌预处理CRC细胞系通过受体TIGIT与具核梭杆菌衍生蛋白Fap2的结合降低了共培养的NK细胞的活性。
九、研究“致癌微生物”的新兴技术
综上所述，尽管在这一领域已经取得了实质性的进展，但尚且缺乏关于改变的菌群与宿主之间在治疗上存在因果作用的证据。编撰一部完整的与CRC相关的包括细菌、真菌、病毒、古细菌和代谢物的丰度和功能菌群谱，并考虑这些因素与宿主之间的多层串扰是一项尚待解决的艰巨任务，而这部分是由于测序深度的限制，特定菌种难以培养以及复现人类肿瘤微环境模型的局限性等。
首先，类器官是上皮组织的三维培养系统，可在体外稳定培养源自患者的肿瘤组织。通过使用该技术，可以测试各种刺激效果，但是对类器官封闭顶端表面的接近性较差，使得具有菌群成分的培养具有挑战性。紧接着，细菌的类器官内显微注射技术的发展和上皮极性逆转的研究已经开始解决这个问题。例如，将pks+E.coli注射至类器官中揭示了这种细菌直接引起临床相关的CRC驱动突变的能力。尽管这种还原论方法有自己的价值，但重要的是要了解致病菌群对基因背景以及来自肿瘤微环境的其他细胞起作用的能力。因此，科研人员将类器官实验扩展到与免疫细胞和间充质细胞共培养，使用CRISPR–Cas9引入靶向突变。
进一步的，科研人员开发了一种称为“器官芯片（organ-on-a-chip）”的体外微流系统，该系统利用特定的通道渗透性整合了多个细胞元素。这种微流体模型称为“HuMIX”，通过共培养营养物质，活微生物和人上皮细胞来产生独特的短链脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）比率，限制IECs的自我更新能力，从而提供了与CRC相关代谢产物的功能性见解。重要的是，该技术已经扩展到可以对厌氧和好氧菌群进行建模，这些进展还将有助于研究微生物内部对必需营养素的竞争，可能与致癌微生物的生长相关。
基因工程小鼠模型（Genetically engineered mouse models, GEMM）构成了这篇综述中讨论的许多研究的基础。然而，一些模型潜伏期较长且不能复现人类疾病的晚期阶段。为了减少模型的持续时间，从而在不发生细菌抗药性的情况下进行抗生素处理，可以将致瘤类器官局部注入实验动物的直肠。对于在体内还原微生物-宿主相互作用的复杂性以及证明CRC的致病因果关系。为了研究晚期CRC，已经设计出转移模型，并提供了工具来研究菌群在调节上皮-间质转化中的潜在作用。
值得注意的是，尽管抗生素是在疾病发展过程中调节微生物群的有用工具，但它们通常针对某些微生物而没有足够的控制或确保根除，从而使数据解释具有挑战性。例如，在DSS-乙氧基甲烷癌症模型中，在无菌小鼠中观察到增强的肿瘤发生，有趣的是，使用抗生素处理的结果却相反。这种看似相反的数据可能是由于具有抗生素抗性菌群的存在，或消除菌群的时间点不同再或者无菌小鼠的免疫系统不同等因素。除细菌和代谢产物外，有越来越多的证据表明真菌，古细菌和病毒也在CRC中发生改变。最近有通过真菌共生体诱导IL-18可抑制结肠炎相关的小鼠CRC，从而突显其保护性作用。
对于这样的集成分析流水线，广泛而系统的“多组学（multi-omic）”方法对于构建交互组（interactome）至关重要，另一个新兴领域是在菌群背景下对表观遗传学进行分析，例如与CRC肿瘤中独特的甲基化模式相关的梭杆菌属。当然，鉴于模型系统之间存在广泛的个体异质性和局限性，因此大规模国际患者队列（包括有关宿主的菌群和遗传特征的综合数据）对于确定临床相关发现至关重要。
图3，研究肠道菌群在CRC中致病作用的方法学
讨论
在过去的十年中迅速累积的研究发现，早期癌前病变的个体与转移性CRC个体的肠道菌群组成存在差异。在CRC中鉴定出的具核梭杆菌，大肠杆菌或脆弱拟杆菌的丰度增加，开创了肿瘤研究的新领域，即微生物可以作为生物标记物与常规诊断方法结合使用。靶向菌群的治疗方法也正在兴起，包括选择性消除致癌菌群，粪便移植抗致癌菌群以及通过口服补充剂或靶向噬菌体疗法使微生物群倾斜。然而，由于微生物组对宿主生物学的多种作用，因此需要谨慎考虑上述治疗手段是否存在副作用。
非常重要的是，当前必须破译某一特定菌株或“致癌”菌群（包括细菌，真菌，病毒，古细菌及其产生的代谢产物）的联合是否会改变疾病状态。由于微生物群中个体内部的异质性很大，那么可以认为，不同个体中的不同菌株将通过共同途径以触发相似的病理改变，因此，针对广泛而非特定的单元研究可能是最有效的策略。
总而言之，这篇综述已经向我们展示了截至目前针对肠道菌群对宿主CRC的各种可能机制，从改变肠道屏障和/或免疫环境到重塑结肠生态位和提供基因毒性损伤等。尽管宿主的适应不良和屏障破坏对于促进宿主与微生物群之间的紧密接触非常关键，但仍需要纵向多组学来解释这些“阶段”在肿瘤发展中的时间顺序。当然，非常幸运的是，目前已有大批新兴技术为在模拟生理CRC系统的背景下研究微生物群，这对于破解结肠肿瘤微环境的挑战性和复杂性提供可能。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-020-2729-3